細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力。如今細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。

一、細(xì)胞復(fù)蘇

將凍存細(xì)胞從液氮中取出后，在37℃水浴鍋內(nèi)不斷搖動(dòng)促進(jìn)其融化。移人15ml離心管中，加入10ml預(yù)熱的DMEM完全培養(yǎng)基，輕輕吹勻，離心，2000rpmX2min，棄上清液。

加入10ml DMEM培養(yǎng)基清洗，棄上清液。加入10ml DMEM完全培養(yǎng)基，輕輕吹打，接種于10cm盤中，在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

二、細(xì)胞傳代

細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時(shí)．去培養(yǎng)基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶，放人細(xì)胞培養(yǎng)箱3min。加人1ml DMEM完全培養(yǎng)基終止胰酶消化，轉(zhuǎn)移至15ml離心管。

加入10ml PBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)盤，轉(zhuǎn)移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。再加入10ml PBS（經(jīng)高壓滅菌，保存于40C），吹勻，吸取10微升進(jìn)行計(jì)數(shù)，按照1×106/盤接種，在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

三、細(xì)胞凍存

細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，去培養(yǎng)基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶，放人細(xì)胞培養(yǎng)箱3min。加入lmlDMEM完全培養(yǎng)基終止胰酶消化，轉(zhuǎn)移至15ml離心管。加入10ml PBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)盤，轉(zhuǎn)移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。

加入lml凍存液（90%血清，10%DMSO），放入凍存盒內(nèi)（盒內(nèi)有異丙醇，以保證溫度降低的速度），立即放入一80℃冰箱內(nèi)，過夜，第二天放入液氮中，可以保存至少兩年，如不放人液氮，可以保存三個(gè)月。

凍存液的配制：70%的完全培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，邊滴邊搖。